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遺傳轉(zhuǎn)化通常是以接種的葉盤在固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織和脫分化為基礎(chǔ)的。建立這樣一個(gè)復(fù)雜系統(tǒng)的過程需要大量的人力和時(shí)間。 如果一個(gè)品種成功轉(zhuǎn)化，其他品種可能不能用相同的方法轉(zhuǎn)化。此外，即使培育出一個(gè)優(yōu)秀的轉(zhuǎn)基因品種，我們應(yīng)用的機(jī)會(huì)也很小。在過去的兒十年里，模式植物的分子生物學(xué)研究取得了令人矚目的進(jìn)展。然而，在與人類休戚相關(guān)的農(nóng)作物、果樹等經(jīng)濟(jì)類植物中，分子水平上的研究卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后，無法滿足人們對其改良育種的需要。這其中一個(gè)重要的原因就是，迄今為止，轉(zhuǎn)基因、基因突變等分子生物學(xué)常規(guī)操作在大多數(shù)植物中依然存在技術(shù)瓶頸，需要我們逐一去突破。 可喜的是，近些年快速發(fā)展起來的一種被稱為病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)有望使這一局面得以改觀。 病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)在植物的基因功能鑒定中是一個(gè)非常有用的工具，與傳統(tǒng)的研究植物基因功能的方法相比，具有簡使高效、周期性短、不需要對植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以及可以沉默基因家族等特點(diǎn)，并且可以在物種間和物種內(nèi)不同遺傳背景的植物間進(jìn)行基因功能的比較。而且，盡管VIGS沒有通過穩(wěn)定的植物轉(zhuǎn)化過程，人們近年來發(fā)現(xiàn)其沉默效應(yīng)也能夠傳遞給后代，這預(yù)示著該技術(shù)有望在作物改良上發(fā)揮巨大的潛力，應(yīng)用前景十分廣闊。 但是自VIGS技術(shù)發(fā)明以來，VIGS載體的應(yīng)用一直是依賴于植物種的。 直到采用Barley stripe mosaic virus(BSMV)載體沉默大麥(Hordeum wulgare)基因的報(bào)道出現(xiàn)，VIGS用于單子葉植物功能基因組的研究才開始起步。近年來，眾多新載體尤其是通用載體的研發(fā)，不斷地拓展VIGS的應(yīng)用范圍。目前，應(yīng)用最廣泛的VIGS載體，有Apple latent spherical virus(ALSV)、Barley stripe mosaic virus(BS-MV)以及Tobacco rattle virus(TRV)等。 蘋果潛伏球形病毒（ALSV）是一種通過病毒誘導(dǎo)作物轉(zhuǎn)錄基因沉默（VITGS）實(shí)現(xiàn)病毒誘導(dǎo)基因沉默（VIGS）、基因表達(dá)和表觀遺傳育種的有效系統(tǒng)。 ALSV不一定能感染所有植物，但它能感染多種作物，如蘋果、梨、櫻桃、大豆、豌豆、黃瓜、西瓜、矮牽牛、桔梗和日本龍膽，感染率相對較高。ALSV載體制備和感染的方案在不同出版物之間有所不同，目前仍通過新的實(shí)驗(yàn)條件試驗(yàn)得到改進(jìn)，以提高感染率并避免插入序列的缺失。 目前看來，最有代表性的方法實(shí)際實(shí)驗(yàn)順序是，載體制備、對本氏煙草進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染、在藜麥中繁殖、病毒顆粒和病毒RNA的提取、最終讓病毒侵染目標(biāo)植物(例如蘋果) 和日本龍膽。 為了讓病毒更有效地侵染目標(biāo)植物，實(shí)驗(yàn)人員常通過刮傷植物并涂抹病毒溶液的方式增加侵染效率，但這種方式需要耗費(fèi)大量的人力和時(shí)間，于是越來越多的實(shí)驗(yàn)室開始選擇用基因槍轟擊的方式提高病毒侵染效率。 Springer在2017年出版的著作《Plant Epigenetics》(植物表觀遺傳學(xué))收錄了日本巖手大學(xué)農(nóng)學(xué)部植物病理學(xué)研究室的文章《Apple Latent Spherical Virus (ALSV) Vector as a Tool for Reverse Genetic Studies and Non-transgenic Breeding of a Variety of Crops》(蘋果潛伏球形病毒(ALSV)載體用于多種作物的反向遺傳研究和非轉(zhuǎn)基因育種)。文章中介紹ALSV載體的特性，以及載體制備和用載體RNA接種植物的實(shí)用方案，并給出了用ALSV載體實(shí)現(xiàn)VIGS和VITGS的例子。載體RNA接種植物時(shí)，實(shí)驗(yàn)室采用了近期引進(jìn)的GDS-80基因槍系統(tǒng)，并指出相比其他基因槍系統(tǒng)，操作更簡單，ALSV感染率較高，同時(shí)該系統(tǒng)的使用也沒有商業(yè)授權(quán)使用限制。 實(shí)驗(yàn)中，每次轟擊粒子均使用5 ug病毒RNA和0.4 mg金顆粒。文章中介紹了40次轟擊的準(zhǔn)備工作，根據(jù)實(shí)驗(yàn)規(guī)模調(diào)整RNA和金顆粒的量。在1.5 mL塑料管中稱出16 mg的金顆粒(0.6 um直徑)。加入50 uL無菌蒸餾水并渦旋振蕩。超聲處理1分鐘。渦旋混合管。將RNA溶液(200 ug RNA，通常為50 uL)一點(diǎn)一點(diǎn)地加入渦旋溶液中。加入10 uL(1/10體積)乙酸銨(5 M)。加入220 uL(兩倍體積)的異丙醇。在-20℃放置1小時(shí)。涂有病毒RNA的金顆粒將沉入溶液底部。用移液器除去上清液。渦流一秒鐘。用1mL 100%乙醇(用分子篩脫水)洗滌金顆粒四次。將金顆粒溶于400 uL的100%乙醇(用分子篩脫水)中。超聲處理一秒鐘以分散。 轟擊之前必須穩(wěn)定植物樣品：否則植物會(huì)被打散并受傷。發(fā)芽后立即將蘋果幼苗綁在柔軟的鋁網(wǎng)之間，用海綿和銅網(wǎng)將龍膽幼苗固定，龍膽幼苗在硬紙板上轟擊，以防止土壤顆粒散布到周圍。向槍管中注入10 uL金顆粒溶液。近距離(1-3厘米)轟擊金顆粒。金顆粒在表面可見為棕色污點(diǎn)。完成所有轟擊后，關(guān)閉氦氣瓶閥，并通過反復(fù)射擊來除去管內(nèi)的氣體。關(guān)閉減壓閥，拆下氣管，然后在水中超聲處理30分鐘，以洗滌槍管。 VIGS技術(shù)應(yīng)用于植物研究，在很多方面優(yōu)于其它的基因阻斷方法，這些優(yōu)勢可能還會(huì)超出我們的想象。 現(xiàn)階段的VIGS已經(jīng)能夠直接應(yīng)用于部分農(nóng)作物，如馬鈴薯、番茄、大豆、小麥、大麥、水稻和玉米。可遺傳的VIGS也有望直接應(yīng)用于農(nóng)作物改良，生產(chǎn)出不含轉(zhuǎn)基因成分的基因改良作物，迄今為止，采用VIGS鑒定植物基因功能的探索已超過10年的時(shí)間。隨著載體和方法上的繼續(xù)進(jìn)步，我們相信VIGS必將在這個(gè)基因組時(shí)代發(fā)揮更重要的作用。 參考文獻(xiàn)： 1. Kasajima, Ichiro & Ito, Makoto & Yamagishi, Noriko & Yoshikawa, Nobuyuki. (2017). Apple Latent Spherical Virus (ALSV) Vector as a Tool for Reverse Genetic Studies and Non-transgenic Breeding of a Variety of Crops. 10.1007/978-3-319-55520-1_25. 2. 孫威, 許奕, 許桂鶯,等. 病毒誘導(dǎo)的基因沉默及其在植物研究中的應(yīng)用[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2015, 31(010):105-110. |
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