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由于對傳統礦物燃料的依賴，人們對潛在的能源危機和環境問題越來越關注，為滿足經濟和社會發展對能源的需求，實現資源的永續利用，促進環境，資源，社會經濟的協調發展，能源問題越來越受到各國研究者的重視。微綠球藻是最有前途的生物燃料和天然產品的原料。相比其他生物燃料原料，如作物和其他陸地植物，微綠球藻具有高脂含量和快速增長的速度。 此外，它們不需要耕地或淡水進行種植，可以利用煙氣中的二氧化碳進行生長。微綠球藻是一種很有吸引力的生物燃料和二十碳五烯酸(EPA)等高附加值產品的工業生產菌株，其生長速度快，脂肪含量高。 微藻的轉化方法主要有三種：玻璃微珠攪拌法、電穿孔法和基因槍粒子轟擊法。 玻璃微珠攪拌和電穿孔通常用于轉化細胞壁缺乏或變弱的微藻。對于具有硬細胞壁的微藻，如硅藻，DNA包覆金屬粒子轟擊靶細胞是一個普遍的，簡單的，有效的和高重現性的轉化方法。該方法已成功地用于大多數標準的細胞表達系統的轉化。基因槍粒子轟擊法的主要缺點是需要專門的設備成本，但它仍然是葉綠體轉化的最有效的方法，因為它允許重組DNA的多個副本傳輸通過細胞膜和葉綠體膜，這增加了成功整合事件發生的機會。此方法已被證明對于穩定的核轉化和葉綠體轉化、在衣藻轉化、團藻轉化、小球藻、橢圓小球藻、雨生紅球藻瞬時轉化和穩定的核變換的硅藻三角褐指藻都是有效的。 也是細胞器轉化的首選方法。值得注意的是，葉綠體轉化可用于微藻細胞工廠生產異源蛋白質和增值產品。有一些報道根據轉化方法描述了轉化子的長期穩定性。根據統計分析，90.6%的作者使用了轟擊法，66.6%和33.3%的作者使用了玻璃珠和電穿孔法，報告了表型的長期穩定性。這一統計分析表明，與玻璃珠法和電穿孔法相比，基因槍轟擊后，外源DNA在轉化子基因組中的存在與長期存活正相關。 韓國科學技術院（KAIST）（也稱韓科院，環太平洋大學聯盟成員）化學與生物分子工程系在Bioresource Technology雜志發表了使用GDS-80基因槍建立微綠球藻穩定轉化體系，首次報道了一種外源熒光蛋白在微綠球藻中的過度表達和檢測，開發了可用于未來遺傳改良的轉化工具箱。 微綠球藻屬于單細胞，浮游生物，具有2-4um直徑的亞球形或3-4×1.5um圓柱形細胞，是一種非常小的細胞類型。通過GDS-80基因槍進行粒子轟擊轉化，在TUB和UEP啟動子的調控下表達Shble，獲得對Zeocin抗生素的抗性，每10的8次方個細胞中分別有5.9和4.7個轉化子。利用限制性內切酶位點定向擴增(RESDA)PCR證實了這些標記與基因組的穩定整合。 實驗方法如下：首先構建攜帶內源性TUB啟動子，TUB終止子和Shble基因(編碼對zeocin的抗性)的pNsShble質粒。通過乙醇沉淀法純化被Xbal線性化的pNsShble。使用2.5M氯化鈣，和0.1M亞精胺將線性化的pNsShble包埋到金粉上。用70%乙醇洗滌金粉混合液，并重懸于100%乙醇中。在改良的F2N培養基中培養N.salina細胞。將醋酸纖維素膜濾器上的10的8次方個細胞置于F2N瓊脂培養基上。使用GDS-80低壓基因遞送系統(Wealtec，USA)進行粒子轟擊：625ug金粉/槍，1ug線性化質粒，3cm距離。轟擊轉化后，將5個醋酸纖維素膜濾器上的細胞在改良的F2N液體培養基中于25℃，5umol光子/平方米/s的熒光下培養1天。收獲所有細胞并接種在含有2.5ug/mL zeocin和F2N瓊脂培養基上。 異源蛋白sfCherry熒光蛋白首次在微綠球藻中高表達和可視化。采用粒子轟擊法，用TUB和UEP啟動子表達Shble基因，每10的8次方個細胞分別獲得5.9和4.7個轉化子。經RESDA-PCR證實，基因整合確保了轉基因的穩定表達。 此外，通過western blotting和共聚焦顯微鏡證實了sfCherry熒光蛋白的轉基因表達和正確功能。這些結果為微綠球藻的遺傳操作提供了技術支持，有助于生物制品的穩定轉化和生產。 參考文獻： Heterologous overexpression of sfCherry fluorescent protein in Nannochloropsis salina[J]. Biotechnology Reports, 2015, 8(C):10-15. |
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